Kultur Jaringan - Sterilisasi Alat

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penting untuk dipahami bahwa tidak semua peralatan laboratorium tahan terhadap proses sterilisasi dengan pemanasan dan tekanan tinggi terutama peralatan yang terbuat dari plastik seperti polypropyline, polymethylpentene yang dapat di autoklaf berulang (Suryowinoto, 1996).

            Meskipun peralatan medium dan bahan tanaman yang digunakan telah diusahakan steril adalah suatu tindakan yang baik bila semua orang yang hendak menanam dengan teknik kultur jaringan dan tangannya relatif aseptik selama bekerja (Zulkarnain, 2009).

            Pemanasan 160 C selama 1 – 2 hari menurut Despatch Oven Company disertakan dengan sterilisasi pada autoklaf pada suhu 121 ° C atau 132 ° C dengan tekanan 15 psi (Hartmann and Kester, 1975).

            Meja kerja steril merupakan padatan penting dalam kegiatan kultur jaringan. Meja kerja steril ditempatkan dalam ruang tanam (ruang transfer) atau (ruang penaman). Disebut meja kerja steril karena prinsip kerja alat ini mengandalkan adanya hembusan udara steril yang dihasilkan oleh dinding filter dengan ukuran sangat kecil (mesh 0,22 – 0,24 mikron), sehinggga mampu menahan bakteri dengan jamur diruang kerja steril (Nugroho dan Sugito, 2000).

            Sterilisasi alat gelas dan metal dapat dilakukan dengan melalui oven agar terbebas oleh bakteri (Hartmann, dkk, 2002).

Alat yang digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan perlatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat dalam suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam yaitu, penggunaan panas, penyaringan , dan penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam, perasetat, formaldehida dan gluturaldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).

Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui cara sterilisasi alat – alat dan bahan tanaman.

Kegunaan Percobaan

-          Sebagai salah satu syarat untuk dapat mengikuti praktikal tes di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan.

-          Sebagai bahan informasi bagi pihak – pihak yang memerlukan.

TINJAUAN PUSTAKA

Pada saat pembuatan media masing – masing larutan stok diambil sesuai konsentrasinya. Selamjutnya diukur dan diatur pH media sesuai yang dianjurkan. Setelah itu dimasak sambil diaduk. Sesudah masak, media dimasukkan kedalam botol kultur sebannyak 10 – 20 ml / botol dan ditutup dengan aluminium foil atau kapas. Setelah itu disterilisasi dalam autoclaf pada suhu 121° C selama                            15 – 20 menit (Mariska dan Sukmadjaja, 2003).

Perlu digarisbawahi disini bahwa upaya keras mengatasi kontaminasi organisme adalah merupakan hal yang sangat penting pada kultur jaringan karena semua media, botol kultur, dan alat – alat yang digunakan untuk menangani jaringan harus diusahakana sama steril sebagaimana bahan tanamaan yang digunakan  (Santoso dan Nursandi, 2004).

Sterilisasi merupakan kunci keberhasilan dan kesuksesan dalam pengembangan mikrobiologi. Untuk mendapatkan semua yang sesuai maka                alat – alat yang digunakan haruslah disterilkan terlebih dahulu. Bila alat yang dipakai tidak steril maka akan terjadi kontaminasi yang merusak hubungan kelangsungan kerja di laboratorium tersebut (Lay, 1994).

Autoclaf merupakan alat yang mensterilkan bermacam – macam alat dan bahan yang digunakan dalam lingkup mikrobiologi yakni  menggunakan uap air yang bertekanan panas (Gabriel, 1988).

Laminar Air Flom Cabinet (LAFC) terlebih dahulu bagian dalam alat ini disemprot dengan alkohol 70 %. Setelah sterilisasi dengan alkohol, tutup pintu Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) dan nyalakan lampu ultraviolet (UV) selama ½ sampai 1 jam. Setelah sterilisasi dengan lampu ultraviolet (UV)  pekerjaan dapat segera dimulai  (Zulkarnain, 2009).

Penggunaan formalin dalam Laminar Air Flow tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat tembus ke arah dada si penabur sehingga berbahaya bagi kesehatan. Alat – alat yang digunakan dalam kultur jaringan setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121°C dengan tekanan 17,5 psi selama 20 – 30 menit. Botol – botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan aluminium foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi alat – alat yakni 15 menit tetapi tekanan dan suhunya sama. Teknik pelaksanaan sterilisasi dengan autoklaf adalah sebagai berikut: Autoklaf diisi sampai air sampai batas atas, kemudian botol – botol eksplan yang berisi medium dimasukkan ke dalamnya. Setelah autoklaf ditutup rapat, kemudian dinyalakan (ada yang model listrik tetapi ada pula yang dipanaskan dengan kompor gas). Setelah autoklaf dinyalakan kemudian ditunggu sampai air didalamnya mendidih dan tekanan menunjukkan angka 15. Pada saat angka menunjukkan 15, mulai dihitung waktunya sampai 15 menit, kemudian autoklaf dimatikan dan ditunggu dahuku sampai agak dingin. Setelah tekanan menunjukkan angka 0, autoklaf tersebut dibuka dan botol – botol                       didalamnya dikeluarkan untuk disimpan sampai saat digunakan                                                             (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Percobaan

Percobaan ini dilaksanakan pada hari sabtu tanggal 26 September 2009 pukul 08.00 WIB sampai dengan selesai. Percobaan ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dengan ketinggian ± 25 m dpl.

Bahan dan Alat

            Adapun bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah aquadest yang digunakan sebagai air dalam autoklaf, alkohol 90 % yang berguna untuk mematikan kuman pada Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), clorox 20 % untuk sterilisasi eksplan, dithane untuk sterilisasi eksplan, Tween 20 untuk sterilisasi eksplan, clorox 10 % untuk sterilisasi eksplan, betadine 5 % untuk sterilisasi eksplan dan air untuk mencuci alat alat yang digunakan.

            Adapun alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah autoklaf digunakan untuk sterilisasi alat dan media, erlenmeyer digunakan untuk tempat dan sarana untuk menuangkan air suling sebagai tempat media, gelas ukur untuk menakar air suling dan bahan kimia yang digunakan, petridish untuk tempat atau wadah eksplan, pipet atau pengaduk untuk mengambil bahan kimia dan untuk mengaduk larutan, pinset untuk memegang, memotong dan menanam eksplan kedalam media, scapel untuk mengiris tanaman yang akan dijadikan eksplan, lampu bunsen untuk memanaskan pisau supaya steril, botol alkohol untuk sterilisasi laminar air flow cabinet, sprayer untuk sterilisasi ruangan, botol kultur untuk tempat percobaan dan aluminium foil untuk menutup botol.

                                                 Prosedur Percobaan

a.      Sterilisasi Alat

·          Dicuci bersih alat – alat yang akan disterilkan.

·         Dicuci autoklaf setelah itu ditambahkan air ke dalam autoklaf

( aquadest ).

·         Dimasukkan botol kultur ke dalam autoklaf.

·         Dimasukkan lagi alat alat yang lain seperti erlmeyer, gelas ukur, gelas piala, petridish, pipet pengaduk, pinset dan scapel.

·         Ditutup autoklaf lalu direbus selama 1 jam dengan tekanan 17,5 psi tetapi sebelum itu ditunggu autoklaf hingga panas.

·         Setelah 1 jam autoklafnya otomatis mati tetapi jangan langsung dibuka ditunggu dulu sampai tekanan turun hingga 10 psi.

·         Lalu autoklafnya dimasukkan kedalam ruangan.

·         Lalu dikeluarkan satu persatu kedalam keranjang dan sterilisasi selesai.

b.      Sterilisasi Media

·         Disterilkan media dengan autoklaf pada tekanan 17,5 psi dan suhu 121 °C selam 30 menit.

·         Diletakkan pada rak simapan media, media yang sudah disterilkan.

c.       Sterilisasi Eksplan

·         Dicuci potongan organ yang akan dijadikan eksplan dengan air bersih selam 2 – 3 kali lalu diletakkan didalam cawan petri atau erlenmeyer.

·         Ditimbang zat kimia yang akan digunakan, lalu dilarutkan aquadest steril dengan persentase yang dikehendaki.

·         Dibawa kedalam LAFC kedua bahan yang LAF terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 96 %.

·         Dimasukkan potongan organ atau eksplan yang akan disterilkan dan dalam larutan pensteril samp[ai waktu yang dikehendaki. Erlenmeyer digoyang atau dishaker agar semua organ dapat kontak langsung dengan pensteril.

·         Dicuci eksplan dengan aquadest steril 2 – 3 kali kemudian dipotong kecil – kecil dengan ukuran 0,5 – 1 cm. Eksplan selanjutnya siap untuk ditanam.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Dari hasil percobaan diperoleh bahwa alat – alat, media, dan eksplan dalam keadaan steril. Alat keadaan steril ditandai dengan botolnya tetap bersih, media dalam keadaan steril ditandai dengan tidak munculnya jamur. Setelah dibuat seminggu, sterilisasi eksplan ditandai dengan tidak munculnya jamur di eksplan.

Pembahasan

Dari hasil percobaan, dapat diketahui bahwa sterilisasi yang dilakukan dilaboratorium dengan menggunakan autoklaf ini dikarenakan autoklaf merupakan alat untuk berbagai macam alat yang akan digunakan dalam percobaan kultur jaringan. Hal ini sesuai dengan literatur Gabriel (1988) yang menyatakan bahwa autoklaf merupakan alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam lingkup mikrobiologi.

Dari hasil percobaan, sterilisasi alat harus dilakukan dalam percobaan kultur jaringan untuk mencegah terjadinya kontaminasi yang dapat merusak kelangsungan percobaan yang dilakukan dilaboratorium. Hal ini sesuai dengan literatur Lay (1994) yang menyatakan bila alat yang dipakai tidak steril maka terjadi kontaminasi yanng dapat merusak kelangsungan kerja dilaboratorium tersebut.

Dari percobaan yang telah dilakukan untuk pensterilan ruangan seperti ruangan untuk penabur atau LAF (Laminar Air Flow) dilakukan dengan menggunakan lampu Ultraviloet (UV) selama ½ sampai 1 jam. Hal ini sesuai dengan literatur Zulkarnain (2009) yang menyatakan bahwa Laminar Air Flow (LAF) terlebih dahulu bagian dalam alat ini disemprot dengan alkohol 70 %. Setelah sterilisasi dengan alkohol, tutup LAF dan nyalakan lampu UV selama ½ sampai 1 jam. Setelah sterilisasi lampu UV pekerjaan dapat segara dimulai.

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa media yang telah dibuat dan dimasukkan kedalam botol kultur ditutup dengan aluminium foil dan disterilisasikan dalam autoklaf pada suhu 121 ° C. Hal ini sesuai dengan literatur Mariska dan Sukmadjaja (2003) yang menyatakan bahwa sesudah masak media dimasukkan kedalam botol kultur sebanyak 10 – 20 ml/ botol dan ditutup aluminium foil atau kapas. Setelah itu, disterilisasi dengan autoclaf pada 121 ° C  selama 15 – 20 menit.

Sterilisasi eksplan pada percobaan ini dilakukan dengan menggunakan alkohol, clorox, dithane, dan betadine karena bahan – bahan kimia tersebut dapat membuat kondisi aseptik. Suatu bahan tanaman terutama permukaan luarnya yang kontak langsung. Hal ini sesuai dengan literatur Doneswamy (1983) yang menyatakan bahwa sterilisasi permukaan membuat kondisi aseptik suatu bahan tanaman. Bahan kimiawi yang diperlukan antara lain alkohol, Ca(Ocl)2), NaOCl yang dipasarkan dalam bentuk clorox, bayclean, dan bahan antibiotika seperti betadine.

                                                                                                           

KESIMPULAN

1.      Sterilisasi alat dilakukan dilaboratorium dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 ° C dan pada tekanam 17,5 psi selama 1 jam.

2.      Alat – alat yang disterilisasi adalah botol kultur, petridish, pipet tetes, stirer, erlenmeyer, pinset, scapel, gelas ukur, dan alat – alat lain yang diperlukan.

3.      Sterilisasi ruang penabur atau ruang tempat pekerjaan dengan menggunakan alkohol 96 %.

4.      Sterilisasi media dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu                121 ° C dan pada tekanam 17,5 psi selama 30 menit.

5.      Sterilisasi eksplan dilakukan dengan menggunakan clorox, dithane, betadine, air dan aquadest.

                                                                                              

DAFTAR PUSTAKA

Doreswany, R. Sriniyasarao, N. K dan E. K. Chako., 1983. Tissue Culture Propagation Of Banana. Scientia. Hortic.

Gabriel, J. F., 1988. Fisika Kedokteran. EGC. Jakarta.

Hadioetomo, R. S., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Hartmann, H. T and D. E Kester., 1975. Plant Propagation. Prantice – Hall, Engelwood Cliffs. New Jersey.

Hartmann, H. T ; D. E Kester ; F. T Davles and R. L Geneve., 2002. Plant Propogation. Prantice Hall of India. Private limited. New Delhi.

Lay., 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Mariska, I dan D. Sukmadjaja. D., 2003. Perbanyakan Bibit Abaka Melalui Kultur Jaringan. BPBSGP. Bogor.

Nugroho, A dan H. Sugito., 2002. Teknik Kultur Jaringan Tanaman.                        UGM – Press. Malang.

Santoso, U dan F. Nursandi., 2004. Kultur Jaringan Tanaman Secara In Vitro. Penerbit Kanisius. Jakarta.

Suryowinoto, M. J., 1996. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. Penerbit Kanisius. Jakarta.

Zulkarnain., 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara. Jakarta.